5. Enzimas

5a. Introdução

Em termos quantitativos, a função das proteínas que domina é a formação de tecidos dos seres vivos. Pode pensar em cabelo, pele, carne, em particular. Todavia, existe um outro tipo de proteínas que não existe em quantidades grandes no corpo, mas sim é muito importante, tendo a função de catalisador dos processos bioquímicos no corpo. Estes biocatalisadores são chamados: "enzimas".

A acção dos biocatalisadores depende em grande parte da forma molecular, em particular da superfície da molécula da própria proteína.
Por exemplo: imagine que certas moléculas do substrato (os reagentes) querem reagir para formar um produto. Só será possível uma reacção no momento que estas moléculas entram em contacto duma maneira bem definida. Não é uma opção real esperar até as moléculas por acaso chocam desta maneira. Mas quando se encontram lá os biocatalisadores, a enzima atrai as moléculas que cabem duma só maneiro na superfície da enzima. Assim as moléculas dos reagentes são ajudadas em chocar exactamente da maneira certa e podem logo reagir formando o produto que logo se afasta da enzima.
Pode ser o substrato que pretende reagir. Cabe muito bem na superfície da enzima, i.é, no centro activo. Uma vez chegado, o substrato pode facilmente (com ajuda dos lugares a, b e c) reagir.

A equação da reacção apresenta-se de seguinte modo:

E + S ES E+P

Onde S = Substrato (reagente), e P = Produto



O funcionamento das enzimas, por consequência, depende da superfície da sua molécula. Qualquer influência que pode mudar esta superfície estraga o trabalho da enzima. Assim, uma acção de desnaturação é desastrosa. A enzima já não funciona. Pode ser uma temperatura alta demais: uma desnaturação irreversível. Ou mudança de pH, ou mudança do ambiente por acrescentar álcool ou sais. As enzimas mostram sempre um valor de pH ou uma temperatura que é o melhor para seu funcionamento: a temperatura óptima ou o pH óptima.

Em termos quantitativos, a função das proteínas que domina é a formação de tecidos dos seres vivos. Pode pensar em cabelo, pele, carne, em particular. Todavia, existe um outro tipo de proteínas que não existe em quantidades grandes no corpo, mas sim é muitíssimo importante, tendo a função de catalisador dos processos bioquímicos no corpo. Estes biocatalisadores são chamados: “enzimas”.
Portanto:
As duas funções principais das proteínas:

  1. Formação de tecidos (músculos, pele, ossos, colágene, armazenamento)
  2. Catálise enzimático (controle das reacções, transmissão de impulsos nervosos, protecção imunitária)

O estudo das proteínas constitui condição base para a compreensão da genética nas aulas de biologia e bioquímica. Este estudo no laboratório inclui - de modo geral e entre outros - a purificação e separação de proteínas, por técnicas como: cromatografia e electroforese.


História

Louis Pasteur (1822 -1895) foi um dos primeiros cientistas a estudar reacções catalisadas por enzimas. Ele acreditava que leveduras ou bactérias vivas eram necessárias para estas reacções, a que denominou fermentações - por exemplo, a conversão  de glicose em álcool por leveduras.
Em 1897, Eduard Büchner fez um filtrado sem células, que continha enzimas preparadas, traturando células de leveduras com areia bem fina. As enzimas contidas neste filtrado converteram glicose em álcool, provando assim que para a actividade enzimática não era necessária a presença de células vivas. Búchner recebeu o Prémio Nobel  de química em 1907 por este trabalho.

Duas características gerais das enzimas:
  1. Enzimas são proteínas (a parte estrutural); têm a estrutura da proteína;têm a possibilidade de desnaturação, em particular sob influência do pH e da temperatura;
  2. Enzimas são (bio)catalisadores (a parte cinética); muito específico e eficiente;holoenzima = apoenzima + coenzima/grupo prostético



5b. A especificidade das enzimas

A acção dos biocatalisadores depende em grande parte da forma molecular, em particular da superfície da molécula da própria proteína.

Por exemplo:
Imagine que certas moléculas do substrato (os reagentes) querem reagir para formar um produto. Só será possível uma reacção no momento que estas moléculas entram em contacto duma maneira bem definida. Não é uma opção real esperar até as moléculas por acaso chocam desta maneira. Mas quando se encontram lá os biocatalisadores, a enzima atrai as moléculas que cabem duma só maneiro na superfície da enzima. Assim as moléculas dos reagentes são ajudadas em chocar exactamente da maneira certa e podem logo reagir formando o produto que logo se afasta da enzima.

Pode ser o substrato que pretende reagir. Cabe muito bem na superfície da enzima, i.é, no centro activo. Uma vez chegado, o substrato pode facilmente (com ajuda dos lugares a, b e c) reagir.



A equação da reacção apresenta-se de seguinte modo:

E  +  S     ES    E  +  P


Onde S = Substrato (reagente), e P = Produto, E é a enzima que participa, mas fica igual ao fim.

Exercício 30
Mais um tipo de catalização enzimática encontra-se na imagem em seguida.
Estude bem a imagem e explique como está garantida a especificidade desta enzima.



A especificidade das enzimas deve-se à forma tridimensional da molécula:


Na figura podemos apenas ver uma imagem didimensional. Uma ideia tridimensional podemos ver na figura. Os dois substratos que reagem podem ser as partes amarela e verde. A imagem - de facto - mostra o complexo enzima+substratos.

Exercício 31
A última reacção (S1+ S2 P) pode ser uma condensação?
Explique a sua resposta.

Erros no DNA ou mutações podem criar confusão no corpo humano, i.é, produzir enzimas com erros no superfície ou falta duma enzima. Tais enzimas deficientes impossibilitam uma das reacções bioquímicas do metobolismo ( eventuais doenças).

Exercício 32
Hemoglobina (Hb) podemos considerar tipo enzima com um activador. Qual é o activador em Hb?

Exercício 33
Num diagrama de energia, mostre o que é 'energia de activação' duma reacção química
Resposta


5c. A estrutura das enzimas

Os dois substratos S1 e S2 ligam-se à enzima especificamente. Outras moléculas aí não cabem (em termos de espaço). O lugar onde se ligam os
Várias vezes, mas não sempre, encontra-se neste centro uma coenzima (ligeiramente) ou um grupo prostéico (bem ligado).
Mudanças na forma do centro activo pode terminar a acção da enzima.
O centro, muitas vezes, tem uma estrutura de fenda, lá dentro mais ou menos apolar.



Coenzimas e grupos prostéicos ( ) facilitam a acção da enzima.
A enzima completa, incluindo cofactores e grupos prostéticos, chama-se holo-enzyme (inglês),
A enzima sem cofactores e grupos prostéticos chama-se apo-enzyme.

Frequentemente, a coenzima é uma vitamina, e a mesma coenzima pode ser associada com enzimas diferentes.
Algumas enzimas requerem uma parte inorgânica, tal como um ião metálico (por exemplo, Ca2+, Mg2+ ou Zn2+).
Este componente inorgânico é um activador. Do ponto de vista funcional, um activador é  equivalente a uma coenzima, mas componentes inorgânicos não são chamados de coenzimas.

A enzima é uma proteína com:

Tipos de enzimas, nomenclatura:

De modo geral, o nome duma enzima começa com o substrato +, em seguida, a actividade da enzima
Oxidoreductases catalisam reacções redox (ex. glucose-oxidase)
Transferases transferem grupos funcionais dum doador para um aceitador.
Hidrolases separar moléculas (ex. peptidases, proteases)
Liases tiram ou juntam certos grupos funcionais (ex. decarboxilase)
Isomerases mudam isómeros (mutase)
Ligases para ligar moléculas (piruvatocarboxilase)


Exercício 34
A que tipo pertencem:
  1. A enzima que pode mudar D-glicose em L-glucose?
  2. A enzima que pode mudar fosfato em fosfito?
  3. A enzima que pode mudar sacarose em glicose e frutose?



5d. Outras propriedades das proteínas

Proteínas são sensíveis para o ambiente, em particular para o valor do pH e a temperatura. Os dois podem causar mudanças na forma tridimensional, até desnaturação.



Desnaturação de proteínas (e polissacarídeos)

Para tal existem vários métodos (por exemplo):

Exercício 35


As figuras mostram a sensibilidade da actividade das enzimas (biocatalisadores) pela temperatura e pH. O eixo-y mostra a actividade da enzima.
Indique nas figuras uma escala de temperatura e pH no eixo-x (uma estimativa)

Exercício 36
Explique o que acontece ao ferver de um ovo durante alguns minutos.

Uma temperatura alta é desastrosa para a enzima:
desnaturação irreversível, enquanto que uma temperatura baixa somente diminui a velocidade/actividade sem desnaturar.
Ao voltar de temperaturas baixas para temperaturas de 30 a 40°C, a actividade volta. (ideia: arrefecer o corpo para depois de muitos anos recuperar?!)

A maior parte das enzimas funciona melhor a valores de pH por volta de 7, mas existem algumas que tem seu óptimo a temperaturas diferentes, por exemplo a pepsina (pH óptima ±1-2).
Mudanças fortes de pH podem desnaturar as enzimas, até irreversível.

Exemplos:
Pepsina 1,5 no estômago
Amilase 6,6 na saliva
Lipase 8,0 resp. 7,0 no pâncreas resp. no intestino
Sacarase 7,0 no estômago


Exercício 37
Que será o pH na boca? Justifique a sua resposta.

O funcionamento das enzimas, por consequência, depende da superfície da sua molécula. Qualquer influência que pode mudar esta superfície estraga o trabalho da enzima. Assim, uma acção de desnaturação é desastrosa. A enzima já não funciona. Pode ser uma temperatura alta demais: uma desnaturação irreversível. Ou mudança de pH, ou mudança do ambiente por acrescentar álcool ou sais. As enzimas mostram sempre um valor de pH ou uma temperatura que é o melhor para seu funcionamento: a temperatura óptima ou o pH óptima.

Exercício 38
No sistema digestivo do homem há várias enzimas que se responsabilizam pela digestão. Todas têm o seu pH óptimo:
sítio enzimas pH-óptimo
Na saliva amilase e maltase 6,6
No estômago peptase, rennase 1,5 - 4
No pâncreas amilase, maltase, lipasse, tryptase, polipeptidase 6,6 - 9
Nos intestinos maltase, sacarase, lactase, ereptase 6,6 - 8,5
  1. Explique as variações nos valores de pH nos quatro lugares
  2. Por quê  sacarase e lactase só aparecem na última parte do sistema de digestão.

Resposta


5e. Regulação da actividade enzimática:

Reacções não catalisadas, que podem requerer horas de fervura na presença de um ácido ou de uma base forte, podem ocorrer em fracções de segundo, na presença da enzima apropriada, à temperatura ambiente e em pH muito próximo do neutro. As enzimas actuam como catalisadores, diminuindo grandemente a energia de activação de reacções bioquímicas específicas. A energia de activação diminuída permite que estas reacções se processem em altas velocidades, à temperatura do corpo.

Existem várias maneiras de regulação da actividade enzimática:
Varias enzimas nem sempre estão disponíveis / prontas para funcionar, mas sim encontram-se no estado de 'pro-enzimas' ou zimogénios. Razões para tal são: a protecção duma enzima vulnerável ou somente necessário no caso de acidentes.
Assim, no estômago, existe a pepsinogénio que pode formar a enzima pepsina a valores baixos de pH. Uma vez formada, a pepsina não pode voltar. O pepsinogénio perda uma cadeia de 44 aminoácidos.

O próprio produto pode (em concentrações altas) voltar, assim proibindo a enzima a continuar sua acção.

Conhecendo a enzima, é possível elaborar substâncias que podem - especificamente - influenciar a acção da enzima (inibidores, moléculas com estruturas comparáveis com o substrato normal, mas não igual), assim impossibilitando a enzima na sua acção regular. Estas drogas usam-se - por exemplo - na quimioterapia para proibir o metabolismo de tumores.

Certas enzimas têm, além do centro activo, um outro sítio onde possam ligar certos grupos; são centros alostéricos. Substâncias que cabem neste centro alostérico podem mudar a forma tridimensional da enzima, incluindo o centro activo, e assim mudar a especificidade ou a actividade. Pode ser uma influência positiva (mais actividade) ou negativo.

Exercício 39
A seguinte afirmação é verdadeira, sim ou não? Explique a sua resposta.
  1. A enzima é um (bio)catalisador que influencia a velocidade da reacção.
  2. Um catalisador acelera (ou reduz) a velocidade V duma reacção química: S P
  3. Explique as letras S, P e V nas suas próprias palavras a um colega.




De modo geral, as reacções bioquímicas são reacções em equilíbrio. Isto implica que a formação do produto chega ao seu máximo depois de algum tempo (t), logo que o equilíbrio se estabeleceu. Sem catalisador, essas reacções são muito lentas; t pode chegar a valores de horas ou dias. A presença do catalisador não aumenta a concentração do produto no equilíbrio, mas sim o tempo necessário para atingir esta concentração. Em vez de dias ou horas, o produto forma-se dentro de segundos (que muda o gráfico).

O biocatalisador - normalmente - acelera o processo químico com factores de 106 ou mais.


        Decurso da reacção

O substrato forma um complexo com a enzima. Este complexo é chamado 'o estado de transição.

Depois a enzima e o produto separam-se.
S + E  ES P  +  E
a                b


A formação do complexo (a) é ema reacção em equilíbrio a; a última reacção b não é. A enzima acelera a obtenção do equilíbrio (não muda o próprio equilíbrio) e acelera a formação do produto.


5f. Michaelis Menten (veja também o anexo)

Cada reacção tem sua própria velocidade V com o seu próprio constante de velocidade k



Com três pressupostos que criam uma situação ideal / óptima, pode-se afirmar que a velocidade chega à velocidade máxima Vmax



Os três pressupostos são:
  1. um estado estationário (steady state) no qual a concentração do intermediário ES não muda; a formação do complexo ES acontece com a mesma velocidade do que a degradação do mesmo.
  2. Toda enzima presente participa;
  3. O sistema encontra-se num ambiente óptima (saturação com S, o melhor pH, a melhor temperatura); assim a velocidade V chega à velocidade máxima Vmax



a velocidade da formação do intermediário ES:



a velocidade da quebra do intermediário ES (para dois lados):





KM é o constante de Michaelis

Exercício 40
Explique como chegar a esta expressão a partir do pressuposto 1.
Resposta

KM mostra a afinidade pela enzima ao substrato; um KM baixo implica muito ES, portanto, muito substrato S;
isto é: pequeno KM implica velocidade maior.

A relação entre a velocidade da reacção e KM pode-se ler na equação de Michaelis Menten:



Os valores de KM   podem variar de 0 até milhares

Exercício 41
Leia bem a tarefa prática laboratorial, tente imaginar esta prática e dá o seu comentário:
Divida-se um extracto neutro (pH=7) da mucosa gástrica em duas partes iguais (A e B).
Acidifica-se a parte A com HCl até atingir o pH 2: esta mistura já não mostra actividade de degradação proteica.
Dilui-se a parte B com um volume igual de água: esta mistura não mostra nenhuma actividade.
Tratam-se ambas as partes, A e B, com base, até atingir um pH 8,5: não há nenhuma actividade enzimática de degradação proteica.
Acidificam depois as duas partes de pH 8,5 para atingir pH 2: Só parte B mostra actividade de degradação proteica.”

Exercício 42
Tente compreender a seguinte descrição duma experiência, junto com os gráficos:
"Na comparação das enzimas, determinam-se os parâmetros de Vmax e Km , medindo a velocidade da reacção (V) em função da concentração do substrato [S]."

Neste caso mede-se, para uma quantidade padrão de hexocinase  ou glicocinase, a velocidade da formação  (V) de GlucoseFosfato (o produto G6P) em função da concentração de glicose (S).
Os resultados mostram que as Vmax das duas enzimas são iguais (formam-se ±100 nmol G6P por minuto), mas os Km diferem bastante:
Km da hexocinase  = 0,1 mM, Km da glicocinase = 10 nM (factor 100)."

Considere mais uma vez o seguinte equilíbrio, com um intermediário SE:



o constante de Michaelis
mostra a afinidade da enzima para o substrato


a equação de Michaelis-Menten
mostra a relação entre KM e a velocidade da reacção

Existem vários tipos de inibição das enzimas:
  1. Inibição pelo produto
  2. Inibição por drogas
  3. Inibição alostérica




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